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烟草NbFER基因及其在烟草种植中的应用

2020/10/9 21:10:40      点击:
 烟草的植株大小和香气成分含量是衡量烟叶品质的两个常重要指标,香气物质决 定了烟草的香型、香气量、香气品质。烟草香气物质分为烟叶香气物质和烟气香气物质,其 中烟叶香气物质包括分子结构比较简单的烷类化合物、多酚类等挥发性香气成分以及黄酮 类、烟碱、萜烯类等分子结构较为复杂的香气前体物。
[0003]自从烟草控制框架公约签署以来,我国卷烟降焦工作取得了重要的进展,但同时 降焦也引起了烟草香气量的下降,因此,培育出低焦油高产香的烟草成为解决这一问题的 关键。基因是控制烟叶香气前体物的关键,这得到了国内外许多研究者的证实,烟叶香气前 体物质的改变进而会影响烟草的香气形成,从基因水平上对烟草研究成为改良烟草产量与 香气品质的有效途径。
[0004] FERONIA (FER)为植物界特有的一种类受体蛋白激酶,在植物生长发育中起到重 要作用,其在双子叶植物拟南芥中调控受精与种子发育(Huck et al.,2003,Rotman et al.,2003),并能够控制种子的大小(Yu et al.,2014a),同时作为植物激素的交叉会话 节点,主要表现为FER对促进细胞伸长的油菜素类酯与生长素的反应起促进作用(Guo et al.,2009; Duan et al.,2010),而对抑制细胞伸长的脱落酸和乙稀起抑制作用(Yu et al.,2012,Yu et al.,2014b)。目前,还没有关于#AFER在烟草中的应用,及其对烟草植 株大小、香气成分含量调控方面的相关报道。
[0005] 在植物基因功能研究中,基因沉默技术是揭示目的基因功能的有效的手段。基因 沉默技术包含多种形式:基因敲除、共抑制、反义RNA、dsRNAi (双链RNA干涉)和VIGS ;其 中,VIGS技术是用携带目的基因片段的病毒侵染植物后,诱导植物体发生基因沉默,可以通 过植物表型或生理指标的变化反映该目的基因的功能。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是:寻找与烟叶植株大小、香气成分相关的功能基因, 进而提供一种可提高烟叶香气成分含量的烟草基因,以及该基因编码的烟草船/?? 功能蛋白,并通过实验证明该基因参与烟草产香前体物的生成,在烟草品种改良领域有应 用价值;再构建含有烟草船/基因沉默的病毒载体及宿主菌株;通过VIGS技术将烟草 船/^X基因应用于烟草种植,进而达到改变烟草植株大小,提高烟叶香气成分的目的。
[0007] 本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的: 本发明涉及一种烟草船尸现基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明涉及一种烟草船尸现功能蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示,由上述 的烟草船基因编码获得。
[0009] 本发明涉及一种提高烟叶香气成分的方法,通过VIGS技术沉默上述的烟草船/?? 基因,获得烟叶香气成分含量高的烟草转化植株。
[0010] 本发明涉及一种提高烟叶香气成分的方法,通过构建含有烟草船基因沉默的 病毒载体并转入农杆菌,并通过农杆菌注射法转化本氏烟草,获得烟叶香气成分含量高的 烟草转化植株。
[0011] 进一步,含有烟草船基因沉默的病毒载体所述病毒载体的构建:以PTRV2-LIC 为骨架,通过选取烟草MfER序列中部位置设计长度200bp-1300bp的目标片段,设计 上下游引物,并在上下游引物端加上相应的LIC接头序列(15bp);再将上述的烟 草NbFER基因片段连入pTRV2-LIC病毒载体中,即为烟草NbFER基因沉默的病毒载体 (pTRV2-LIC-NbFERs)〇
[0012] 进一步,所述农杆菌注射法转化本氏烟草的注射量为0. 5~lmL/株,农杆菌菌液0D 为 1. 0~1. 5〇
[0013] 进一步,所述农杆菌为GV3101农杆菌。
[0014] 本发明的烟草NbFER基因,其长度为2667bp,编码888个氨基酸,大约为72. 8KD ; 该基因编码成的氨基酸与其他物种中的FERs有较高的同源性,其中与模式植物拟南芥中 的AtFER编码的氨基酸同源性高达72. 3%。
[0015] 为了对烟草NbFER基因的功能进行验证分析,我们构建了 pTRV2-LIC-NbFERs病毒 载体,并转入农杆菌GV3101中,通过注射法转化本氏烟草,进而,获得了烟草NbFER基因抑 制表达的本氏烟草和对照组烟草。通过比较分析,发现烟草NbFER基因沉默后,烟叶叶片变 小,叶颜色泛黄(如图3所示),同时对烟草的香气成分进行分析,我们发现其中醇类、酯类、 苯类物质在实验组与对照组中的含量具有显著性差异(参见表1)。由于醇类、酯类、苯类对 烟草中最终香气的生成有重要的作用,因此,如果调控该基因在烟草中的表达可以获得烟 叶香气成分含量高的烟草转化植株。
【附图说明】
[0016]图1为本发明烟草NbFER功能蛋白与其他物种中FERs的氨基酸序列比对图; 图2为本发明pTRV2-LIC病毒载体图谱; 图3为本发明烟草pTV2-PDS载体与pTRV2-LIC-FERs载体转化组的表型比较图。
【具体实施方式】
[0017] 下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0018] 下述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实验方法所用的试剂,如无特 殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到。
[0019] 本实施例包括以下步骤: 1、烟草NbFER基因合成及载体构建: 1)引物设计:从NCBI中获得本氏烟草中H)S、FER基因的编码序列,以PDS基因的编码 序列为模板,选取位于PDS基因中部的序列为目标片段设计引物,并在上游引物F1的上游 5'端加入Kpnl限制性内切酶酶切位点和保护碱基;在下游引物R1的5'端加入BamHI限 制性内切酶酶切位点和保护碱基; NbPDS-F :5' -CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC- 3'(下划线为 Kpnl 酶切位点) NbPDS-R :5' -CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC- 3'(下划线为 BamHI 酶切位点) 选取NbFER基因的编码序列中部位置为目标片段(200bp-1300bp),设计上下游引物, 并在上下游引物端加上相应的LIC接头序列(15bp)。
[0020] NbFER-F :5'-CGACGACAAGACCCTAAGTCGTCAACCTCTGATGCTGC- 3' (下划线为接头序列) NbFER-R: 5' -GAGGAGAAGAGCCCTTCACTCCATGACCTAAACATACCAG-3' (下划线为 LIC 接头 序列) 2)PCR克隆:PCR反应扩增NWDSs及NbFERs基因片段,PCR反应体系(20yL),PCR 反 
应条件:98°C预变性3min ;98°C变性15s,60°C退火15s,68°C延伸45s,32个循环后,72°C 继续延伸l〇min,在72°C延伸lOmin前加入普通Taq酶,完成后在4°C保存。
[0021] 3)PCR产物鉴定:将NWDSs及NbFERs的PCR产物胶回收,与pMD18-T载体连接, 转化感受态大肠杆菌ToplO,涂Amp抗生素的平板,采用菌落PCR进行初步筛选后,将阳性克 隆送往博尚测序公司进行测序及BLAST分析,BLAST分析结果如图1所示。
[0022] 2、烟草NbFER基因在烟草细胞中进行真核细胞表达: 1)重组pTVOO-PDSs载体的构建:将阳性质粒pMD18-T-NbPDSs经BamHI和Kpnl双 酶切后回收,与同样经BamHI和Kpnl双酶切回收后的pTVl混合,加入T4连接酶及连接 buffer,连接过夜后,转化感受态Top 10,涂LB平板(含有50mg/L Kan ),37 °C过夜培养后,即 可以进行获得单菌落,进行菌落PCR鉴定可以获得pTVOO-PDSs。
[0023] 2)重组TRV2-LIC-FERs载体的构建:先用限制性内切酶Pst I将TRV2-LIC质粒 进行单酶切,然后用T4 DNA聚合酶分别处理TRV2-LIC质粒单酶切产物和NbFERs基因片 段,最后将分别用T4 DNA聚合酶处理后的质粒和基因片段进行连接,连接产物转化感受态 ToplO,涂布LB平板(含有50mg/L Kan)培养,37°C过夜倒置培养形成单菌落,即可获得重 组载体 TRV2-LIC-FERs。
[0024] 3)获得 pTVOO-PDSs 及 pTV2-LIC-FERs 的农杆菌菌株:将 pTV00-PDS 及 pTV2-LIC-FERs的阳性克隆质粒(通过测序或酶切签定,表达载体中的目的基因阅读框架正 确)转化入GV3101感受态细胞,涂布LB平板(含有50mg/L Kan、50mg/L Rif)培养,28°C倒 置培养2d,形成单菌落,并利用菌落PCR筛选出携带目的基因的农杆菌。
[0025] 4) PDSs-VIGS 及 FERs-VIGS 接种与检测:挑菌 pTVOO-PDSs 及 pTV2-LIC-FERs 单 克隆的农杆菌在5mL的LB双抗(50 y g/mL kan+15 y g/mL gentamycin)培养液中26°C小摇 过夜。取20W菌液到20 ml LB培养基中,加入等比例的抗生素,摇菌至0D值为1.0~1. 5, 1500g 离心 15~30min,取菌体配制溶液(20 ml LB+100 ml/L MES+20 Mm/L AS),菌液 0D 值 调至1. 0~1. 5,室温放置3-6h,备用。
[0026] 3、本氏烟草转化 以在人工气候室内培养3-4周(培养条件为培养温度22 °C、湿度30%,光/暗周期为 16h/8h)的本氏烟草作为烟草注射用的实验材料,烟草植株性状如图3 (a)所示。
[0027] 将上述制备好的pTVOO-PDSs及pTV2-LIC-FERs单克隆的农杆菌菌液以0?5~lmL/ 株注射至本氏烟草中。
[0028] 注射后的本氏烟草放置于22°C并用黑色薄膜进行遮光培养1~2天,然后在22°C、 湿度30%和光/暗周期为16h/8h的人工气候室内培养,观察烟草的表型变化。
[0029] 以在人工气候室中培养3-4周的本氏烟草为实验材料,通过注射法将含有 pTVOO-PDSs病毒载体的农杆菌注射入烟草中后,发现侵染组pTVOO-PDSs病毒载体的植株 新长出的叶片有漂白现象,说明侵染成功,而含有pTV2-LIC-FERs病毒载体的植株变得矮 小,叶片也变得比对照组的要小,参见附图3,说明烟草NtFER基因在烟草中对烟叶的大小 及产量有一定的调控作用。
[0030] 转化了 PTV2-LIC-FERS单克隆的农杆菌的本氏烟草(实验组)的烟叶香气成分含量 与对照组相比也有明显提高,如表1所示,乙酰苯是烟叶的主要香气成分,其含量相对对照 组提高了 6. 45倍;其次,实验组烟叶中的1,2, 3, 5-四甲基苯、对异丙基甲苯、萘、正丁基异 氰酸乙酸酯相对对照组的含量得到显著提高,说明烟草基激在烟草中对烟叶的香气 成分有一定的调控作用。
[0031] 表1对照组与烟草NbFER基因沉默实验组的烟草烟叶香味成分比较分析
【主权项】
1. 一种烟草船/??基因,其特征在于:烟草船/??基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。2. -种烟草船/??功能蛋白,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示,由权利 要求1所述的烟草船/??因编码获得。3. -种提高烟叶香气成分的方法,其特征在于,通过VIGS技术沉默如权利要求1所述 的烟草#/???基因,获得烟叶香气成分含量高的烟草转化植株。4. 如权利要求3所述提高烟叶香气成分的方法,其特征在于,通过构建含有如权利要 求1烟草船/??基因沉默的病毒载体并转入农杆菌,并通过农杆菌注射法转化本氏烟草,获 得烟叶香气成分含量高的烟草转化植株。5. 如权利要求4所述提高烟叶香气成分的方法,其特征在于,含有如权利要求1烟 草船/??基因沉默的病毒载体所述病毒载体的构建:以PTRV2-LIC为骨架,通过选取烟草 似FER序列中部位置设计长度200bp-1300bp的目标片段,设计上下游引物,并在上下游引 物5<端加上相应的1^1(:接头序列(15&?);再将上述的烟草^^£1?基因片段连入?了1^2-1扣 病毒载体中,即为烟草NbFER基因沉默的病毒载体(pTRV2-LIC-NbFERs)。6. 如权利要求4或5所述提高烟叶香气成分的方法,其特征在于,所述农杆菌注射法转 化本氏烟草的注射量为0. 5~lmL/株,农杆菌菌液OD为I. 0~1. 5。7. 如权利要求4或5所述提高烟叶香气成分的方法,其特征在于,所述农杆菌为 GV3101农杆菌。
【专利摘要】本发明公开了一种烟草<i>NbFER</i>基因及其编码的烟草<i>NbFER</i>功能蛋白,还构建了烟草pTRV2-LIC-FERs基因沉默载体,该载体以pTRV2-LIC为骨架,选取<i>NbFER</i>基因中部位置,设计了长度为500bp左右的片段,将其连入pTRV2-LIC病毒载体中,通过农杆菌注射转化本氏烟草,获得烟草<i>NbFER</i>基因沉默的烟草。通过实验比较发现,烟草<i>NbFER</i>基因可以正调节烟草叶片的大小,同时对烟草中与香气相关的醇类、酯类、苯类物质有调节作用,表明<i>NbFER</i>在烟草产量及香气成分合成方面有及其重要的调控作用。